引言
在开展比对、组装或变异检测等下游分析之前，二代测序数据的质量控制（QC）是不可省略的第一步。尽管 Illumina 等二代测序平台具有高通量和高性价比优势，但其测序过程仍会引入多种技术噪音，如 reads 3′ 端碱基质量下降、接头污染、PCR 扩增偏好及随机测序错误等。这些低质量序列若直接进入下游分析，将显著影响结果的可靠性：在参考基因组比对中会增加错配与多重比对，在变异检测中会引入假阳性信号，在 de novo 组装中则可能导致 contig 断裂或错误拼接。因此，质控的目的并非“美化数据”，而是最大限度降低技术误差，保留真实的生物学信息。基于此，FastQC、Fastp 和 Trimmomatic 等工具被广泛用于二代测序数据的质量评估与过滤，从不同层面构建起稳定、可靠的二代测序数据质控流程，为后续分析奠定坚实基础。
Fastqc
安装
mamba install bioconda::fastqc
质控
fastqc Clean_P636_YMiao_A01v1_S0-1_S1_L002_R1_001.fastq.gz \
Clean_P636_YMiao_A01v1_S0-1_S1_L002_R2_001.fastq.gz
每个测序文件会输出一个对应的html文件，记录了每个指标的检测情况。
结果解读
通过下列11项指标来进行测序质量的评估：
1. Basic Statistics
统计数据量和reads长度等基本指标
2. Per base sequence quality
用箱式图的方式展示数据质量，图中X轴每1个位置，都是该位置的所有序列的测序质量的统计。纵轴是质量得分，Q =-10*log10(p)，p为测错的概率。所以一条reads某位置出错概率0.01时，其quality就是20。横轴是测序序列的位置。蓝色线是各个位置的平均值的连线。一般要求此图中，所有位置的10%分位数大于20,也就是常说的Q20过滤。。如果任何碱基质量低于10,或者是任何中位数低于25报警，如果任何碱基质量低于5,或者是任何中位数低于20报错。
3. Per tile sequence quality
这一模块是检查在测序平台上，reads中每一个碱基位置在不同的测序小孔之间的偏离度，偏离度越高，碱基质量越差。纵轴表示测序小孔，蓝色表示低于平均偏离度，越红则说明偏离平均质量方差越多，也就是说质量越差，本图中都是蓝色表明质量很好。如果出现质量问题可能是短暂的，如有气泡产生，也可能是长期的，如在某一小孔中存在杂质。偏离度小于平均值2以上报警，偏离度小于平均值5以上不合格。
4. Per sequence quality scores
这是为了检测一部分质量特别差的reads，如果有则会在图上出现多个峰，如在测序仪边缘的reads。纵轴是reads数目，横轴是质量分数，代表不同Phred值对应了多少的reads。本图中，测序结果主要集中在高分中，证明测序质量良好。当峰值小于27（错误率0.2%）时警报，当峰值小于20（错误率1%）时不合格。
5. Per base sequence content
展示碱基含量分布，它根据碱基的位置对每个位置上的A,C,G,T的含量进行统计，横轴为位置，纵轴为百分比。正常情况下四种碱基的出现频率应该是接近的，而且没有位置差异。因此好的样本中四条线应该平行且接近。当部分位置碱基的比例出现bias时，即四条线在某些位置纷乱交织，往往提示我们有overrepresented sequence的污染。当所有位置的碱基比例一致的表现出bias时，即四条线平行但分开，往往代表文库有bias (建库过程或本身特点)，或者是测序中的系统误差。当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%发出警报，超过20%则数据不合格。
6. Per sequence GC content
红色曲线是实际的测序GC含量分布图，而蓝色曲线则是理论分布（正态分布，不过均值不一定都是50%，而是由平均GC含量推断的）。如果红色曲线形状存在比较大的偏差，往往是由于文库污染造成的。红色曲线越平滑越好，越接近蓝色曲线越好。形状接近正态但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差。偏离理论分布的reads超过15%时发出警报，超过30%时报不合格。
7. Per base N content
纵轴是百分含量，横轴是read的位置，当测序仪不能确切地测定出某一个碱基时就会标注为N，正常情况下N的比例是很小的，所以图上常常看到一条直线。当看到有峰时，说明测序出了问题。当任意位置的N的比例超过5%警报超过20%不合格。
8. Sequence Length Distribution
每次测序仪测出来的长度在理论上应该是完全相等的，但是总会有一些偏差，如此图中，151bp是主要的，但是还是有少量的150和152bp的长度，不过数量比较少，不影响后续分析，当测序的长度有很大不同时，则表明测序仪在此次测序过程中产生的数据不可信，但对于某些测序平台，具有不同的read长度是完全正常的。当reads长度不一致时警告，当有长度为0的read时不合格。
9. Sequence Duplication Levels
横轴为reads重复的次数，纵轴为重复次数对应的reads占不重复的reads的比例。测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication，这是正常的现象，但如果duplication的程度很高，那么表明存在富集的偏好（enrichment bias）（比如：测序过程中的PCR重复，转录组测序中某些基因表达量高），序列重复比例越高，则表明实际有用的序列越少。图中有蓝红两条线，蓝色线表示的是文件中所有的序列中duplicate程度的分布，红色线表示的是去冗余之后的序列，含量表示的在全部序列都考虑时不同冗余程度的序列所占的比例。重复reads占总数的比例大于20%时警报，大于50%时不合格。
10. Overrepresented sequences
如果有某个序列大量出现，就叫做over-represented。标准是占全部reads的0.1%以上。但是因为用的是Duplicate sequences前200,000条数据，所以有可能over-represented reads不在里面，参考意义不大。
11. Adapter Content
此图衡量的是序列中两端adapter的情况，如果在fastqc分析的时候-a（指定含adapters序列文件）选项没有内容，则默认使用图例中的通用adapter序列进行统计。含有adapter超过所有reads的5%的警告，超过10%不合格。
以我这个测序数据为例，主要的问题是含有大量的接头序列，并且reads的前1-15位置的碱基不是很稳定，后面要着重处理。
Fastp对原始数据进行过滤
当我们通过FastQC对测序数据质检，知道数据有哪些错误后，就可以通过fastp和trimmomatic等过滤软件进行针对性的质控，这里我们选择fastp。
安装
mamba install bioconda::fastp
过滤
fastp -i fastp_P636_YMiao_A01v1_S0-1_S1_L002_R1_001_fastqc.html \
-I fastp_P636_YMiao_A01v1_S0-1_S1_L002_R2_001_fastqc.html \
-o fastp_fastp_P636_YMiao_A01v1_S0-1_S1_L002_R1_001_fastqc.html \
-O fastp_fastp_P636_YMiao_A01v1_S0-1_S1_L002_R2_001_fastqc.html \
-t 8 \
-f 15 \
-5
# -i,-i 输入的测序数据
# -o,-O 输出的过滤后
测序数据
# -t cpu
# -f 删除reads头部前15个碱基